親權鑒定技術規(guī)范-SF/Z JD0105001-2010-（2010年4月7日發(fā)布實施）
1 范圍
    本標準規(guī)定了我國法醫(yī)DNA實驗室進行親權鑒定所必須遵循的技術要求。
    本標準適用于從事親權鑒定的DNA實驗室，不適用于大通量數(shù)據(jù)庫的比對。
2 規(guī)范性引用文件
    下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本部分的條款。凡是注明日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可適用這些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本適用于本部分。
    CNAS-CL01:2006 檢測和校準實驗室認可準則
    GA/T382－2002 法庭科學DNA實驗室規(guī)范
    GA/T383－2002 法庭科學DNA實驗室檢驗規(guī)范
3 術語和定義
    下列術語和定義適用于本標準。
3.1  親權鑒定 Parentage Testing
親權鑒定是通過對人類遺傳標記的檢測，根據(jù)遺傳規(guī)律分析，對個體之間血緣關系的鑒定。
3.2  三聯(lián)體親子鑒定 Parentage Testing of Trios
    被檢測男子、孩子生母與孩子的親子鑒定
3.3  二聯(lián)體親子鑒定 Parentage Testing of Duos
    被檢測男子與孩子的親子關系鑒定。
    注：被檢測女子與孩子的親子關系鑒定也屬于二聯(lián)體親子鑒定，但本標準界定的是被檢測男子與孩子的親子關系鑒定。
3.4  祖孫親緣關系鑒定 Kinship Analysis of Grandparents and Grandchildren
    祖孫親緣關系鑒定是通過對人類遺傳標記的檢測，根據(jù)遺傳規(guī)律分析，對有爭議的祖父母與孫子女血緣關系的鑒定。
3.5  遺傳標記 Genetic Marker
具有多態(tài)性的基因座。用于親子鑒定的遺傳分析系統(tǒng)由一定數(shù)量的遺傳標記組成，常用的有常染色體短串聯(lián)重復序列（STR）、Y染色體短串聯(lián)重復序列（Y-STR）、X染色體短串聯(lián)重復序列（X-STR）。
3.6  排除概率 Power of Exclusion, PE
    對于不是孩子生父的隨機男子，遺傳分析系統(tǒng)具有的排除能力。它是遺傳分析系統(tǒng)效能的評估指標。
3.7  親權指數(shù) Paternity Index, PI
    親權指數(shù)是親權關系鑒定中判斷遺傳證據(jù)強度的指標。它是兩個條件概率的似然比率:
    PI =  概率(檢測到當事人的遺傳表型假設被檢測男子是孩子的生物學父親)÷
概率(檢測到當事人的遺傳表型假設一個隨機男子是孩子的生物學父親)

4   檢驗程序
4.1 采樣要求
    對于三聯(lián)體，采集被檢測男子、孩子生母與孩子的樣本用于檢驗；對于二聯(lián)體，采集被檢測男子與孩子的樣本用于檢驗；對于祖父母與孫的鑒定案例，則采集被檢測祖父、祖母、孩子生母與孩子的樣本用于檢驗。樣本一般是血液（斑）或口腔拭子（唾液斑），其它人體生物學材料如帶毛囊毛發(fā)、羊水、組織塊、精液（斑）等亦可作為親權鑒定的樣本。樣本必須分別包裝，注明被采樣人姓名、編號、采樣人、采樣日期等，置于冰箱冷藏或凍存。
    采樣時，需要填寫采樣單，寫明委托方名稱、采樣日期、采樣類型、被采樣人姓名、性別、稱謂、出生日期、證件號碼等，并拍攝被采樣人照片，由被采樣人在采樣單上留下右手拇指或食指指紋（嬰兒可留右腳拇趾?。?，并簽名確認（嬰幼兒的姓名由其監(jiān)護人代簽）。
    對于接受了外周血干細胞移植的當事人，應避免采集其血樣作為檢驗材料，宜取其口腔拭子（唾液斑）或毛發(fā)進行檢驗。
4.2 DNA提取
    采用Chelex-100法（見如下步驟）或其它經過了驗證的方法抽提DNA。若不經過DNA抽提而直接將檢材用于PCR，方法必須經過驗證。
4.2.1  從血樣中提取DNA：
    a)   在1.5 mL離心管中加1 mL 純水，然后加入血樣（不少于3 μL血液或9 mm血斑），小心混勻；放置30 min，間歇振蕩；
    b)   10,000-15,000 r/min離心2-3 min；小心移去上清液。若樣品為血斑，則保留載體；
    c)   沉淀中加入5% Chelex 100（100-200目）200 μL，56℃保溫30 min；
    d)   高速振蕩5-10 s；沸水浴8 min；
    e)   高速振蕩5-10 s；10,000-15,000 r/min離心2-3 min，取上清液用于擴增反應；2-8℃保存或凍存剩余DNA。
4.2.2  從口腔刮拭物樣本中提取DNA：
    a)   用牙簽刮拭口腔粘膜，將其放入1.5 mL離心管內，加入200 μL 5% Chelex（100-200目)；攪動，使細胞脫落；
b)   56℃保溫15-30 min；
    c)   高速振蕩5-10 s，沸水煮8 min；
    d)   高速振蕩5-10 s，10,000-15,000 r/min離心2-3 min；
e)   取上清液用于擴增反應；2-8℃保存或凍存剩余DNA。
(STR分型檢測一般實驗對樣本的要求10萬個細胞以上即可，盡管對于口腔拭子樣本一根棉簽上就可以附著10萬個口腔黏膜細胞，但作為DNA親子鑒定樣本， 在方便采集的情況下，盡可能采集5-6根棉簽。根據(jù)我國2010年4月10日國家發(fā)布的親權鑒定技術規(guī)范SF/Z JD0105001-2010中的規(guī)定口腔拭子提取DNA……
STR分型檢測一般實驗對樣本的要求:細胞數(shù)量≥106個，DNA含量>20ng/μl，體積大于20μl。對于毛發(fā)樣本一般提供最少5根帶毛囊的毛發(fā)（同時要求5歲以上的，因為5歲以下的毛囊長得不是很完全）。根據(jù)我國2010年4月10日國家發(fā)布的親權鑒定技術規(guī)范SF/Z JD0105001-2010中的規(guī)定毛發(fā)拭子提取DNA……
4.2.3  從毛發(fā)中提取DNA：
    a)   用純水清洗毛發(fā)；剪取毛根部分，放入1.5 mL Eppendorf管中；
    b)   加入200 μL 5% Chelex 100（100-200目）及2 μL 10 mg/mL PK（蛋白酶K），56℃保溫6-8 hr或過夜；
    c)   高速振蕩5-10 s；沸水煮8 min（注意毛發(fā)應浸沒于Chelex液中）；
    d)   高速振蕩5-10 s；10,000-15,000 r/min離心2-3 min；取上清液用于擴增反應，2-8℃保存或凍存剩余DNA。
4.2.4  從精液中提取DNA：
    a)   取精液（不少于3 μL）放入1.5 mL離心管內，加入200 μL 5% Chelex 100（100-200目）；
    b)   加入2 μL 10 mg/mL蛋白酶K和7 μL 1 mol/L DTT，輕輕混勻；
    c)   56℃保溫30-60 min，高速振蕩5-10 s；
    d)   10,000-15,000 r/min離心10-20 s；
    e)   沸水煮8 min；
    f)   高速振蕩5-10 s；
    g)   10,000-15,000 r/min離心3 min；
    h)   取上清液用于擴增反應；
    i)   2-8℃保存或凍存剩余DNA， 再次使用時重復步驟f)-h)。
4.2.5  從精斑樣品中提取DNA：
    a)   適量精斑檢材，剪碎后放到1.5 mL離心管中；
    b)   加入1 mL純水，室溫保溫30 min；
    c)   高速振蕩1 min，用牙簽去除載體；
    d)   10,000-15,000 r/min離心2 min；
    e)   去上清僅留50 μL，用無菌吸頭吹打沉淀；
    f)   加入5% Chelex 100 100-200目）至200 μL，加入2 μL 10mg/mL蛋白酶K和7 μL 1 mol/L DTT，輕輕混勻；
    g)   56℃保溫60 min；
    h)   高速振蕩5-10 s，10,000-15,000 r/min離心10-20 s；
    i)   沸水煮8 min；
    j)   高速振蕩5-10 s，10,000-15,000 r/min離心3 min；
    k)   取上清液用于擴增反應；
    l)   2-8℃保存或凍存剩余DNA，再次使用時重復步驟i)-k)。
從人體組織塊中提取DNA：
    a)   取適量組織塊，用純水沖洗；
    b)   剪碎（或研磨成碎塊），加入1 mL STE提取液（100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCI，1 mmol/LEDTA，pH8.0)，混勻后加入20% SDS 75 μL，10 mg/mL 蛋白酶K 40 μL，于56℃酶解至清；
    c)   于1.5 mL離心管中加入200 μL 10% Chelex 100（100-200目），加入上述酶解后溶液20 μL，混勻；
    d)   56℃保溫30 min；
    e)   劇烈振蕩5-10 s；
    f)   沸水煮8 min；
    g)   劇烈振蕩5-10 s；10,000-15,000 r/min離心3 min；取上清液用于擴增反應；
    h)   2-8℃保存或凍存剩余DNA，再次使用時重復步驟g)。
4.2.7  從羊水中提取DNA：
    a)   取羊水約1.5 mL，10,000~15,000 r/min離心5 min，棄上清；
    b)   在沉淀中加入200 μL 5% Chelex（100-200目）溶液和20 μL 10 mg/mL PK，56℃保溫3 hr；
    c)   高速振蕩5-10 s，沸水浴8 min；
    d)   高速振蕩5-10 s，10,000~15,000 r/min離心5 min，取上清液用于擴增反應；
    e)   2-8℃保存剩余DNA，再次使用時重復步驟d)。
4.3 DNA定量分析
    按照中華人民共和國公共安全行業(yè)標準GA/T382-2002和GA/T383-2002的要求進行。
4.4 PCR擴增與分型
4.4.1 基因座
    選用多態(tài)性基因座（如STR、SNP等類型）進行PCR擴增，其中，常染色體STR基因座宜符合如下要求：（1）經過群體遺傳學調查，多態(tài)性高，非父排除率在0.7以上。（2）經過500次以上減數(shù)分裂的家系調查，基因座的突變率在0.002以下。目前，建議采用商品化試劑盒進行檢驗，檢測系統(tǒng)的累計非父排除率應達到99.99%以上。除常染色體基因座外，建議在需要時增加Y-STR、X-STR的檢驗。其中，Y-STR系統(tǒng)可選擇DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS458、DYS19、DYS385 a/b、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、Y GATA H4、DYS437、DYS438、DYS448等基因座進行單倍型檢驗；X-STR系統(tǒng)可選用GATA172D05、HPRTB、DXS6789、DXS6795、DXS6803、DXS6809、DXS7132、DXS7133、DXS7423、DXS8377、DXS8378、DXS9895、DXS9898、DXS10101、DXS10134、DXS10135、DXS10074等。
4.4.2 擴增試劑
    建議選用商品化試劑盒（帶熒光標記的PCR體系）。若選用其它來源的擴增體系，須經驗證、認可后方可用于日常檢案。每批檢驗均應用標準樣品（已知濃度和基因型的Control DNA）和（或）以前檢驗過的、已知基因型的樣本作為陽性對照，以不含DNA的樣本作為陰性對照。
4.3 PCR體系與溫度循環(huán)參數(shù)
    按試劑盒的操作說明書進行。
4.4.4 擴增產物的檢測與結果的判讀
    使用熒光分析儀，對PCR產物進行毛細管電泳分析，使用等位基因階梯（Ladder）作為參照品來判別樣本的基因型，步驟方法按照儀器操作手冊。
4.5 鑒定意見
    鑒定意見是依據(jù)DNA分型結果對是否存在親權關系作出的判斷。鑒定意見一般分“排除存在親權關系”和“支持存在親權關系”兩種情形。
4.5.1 排除存在親權關系
    經過累計非父排除率大于99.99%的多個基因座的檢測，發(fā)現(xiàn)有3個以上的基因座不符合遺傳規(guī)律，可以排除親權關系的存在。
4.5.2 支持存在親權關系
    經過累計非父排除率大于 99.99%的多個基因座的檢測，發(fā)現(xiàn)基因座均符合遺傳規(guī)律，此時必須計算親權指數(shù)PI（即似然率LR），若CPI≥10000，則支持親權關系的存在。
4.5.2.1  累積親權指數(shù)計算：
    CPI=PI1×PI2×PI3×…×PIn (1、2、3、n代表第1、2、3、n個基因座的PI值)
4.5.2.2 常染色體STR體系各種遺傳組合PI值計算方法：
    見表1~3，表中p、q、r分別表示等位基因P、Q、R的分布頻率。
表1 三聯(lián)體常染色體STR基因座親權指數(shù)計算公式
生母基因型 孩子基因型 生父基因（推斷） 被檢父基因型 PI值計算公式
PP PP P PP 1/p
PP PQ Q QQ 1/q
PP PP P PQ 1/(2p)
PP PQ Q QR 1/(2q)
PP PQ Q PQ 1/(2q)
PQ QQ Q QQ 1/q
PQ QR R RR 1/r
PQ QR R RS 1/(2r)
PQ PR R PR 1/(2r)
PQ QQ Q QR 1/(2q)
PQ PQ P或Q PP 1/(p+q)
PQ PQ P或Q QQ 1/(p+q)
PQ PQ P或Q PQ 1/(p+q)
PQ PQ P或Q PR 1/[2(p+q)]
    表2 二聯(lián)體常染色體STR基因座親權指數(shù)計算公式
孩子基因型 被檢父基因型 PI值計算公式
PP PP 1/p
PP PQ 1/(2p)
PQ PP 1/(2p)
PQ PQ (p+q)/(4pq)
PQ PR 1/(4p)
    表3 祖孫常染色體STR基因座親權指數(shù)計算公式
祖父母 孩子 孩子生母 孩子生父基因 親權指數(shù)計算公式
PR × QS           PQ PQ P或Q 1/[2(p+q)]
  PQ × PR PQ PQ P或Q 3/[4(p+q)]
PQ × PQ PQ PQ P或Q 1/(p+q)
PP × PQ PQ PQ P或Q 1/(p+q)
PP × PQ PQ QS P 3/(4p)
PR × RS PP PQ P 1/(4p)
PR × QS PP PQ P 1/(4p)
PQ × PR PP PQ P 1/(2p)
PQ × PQ PP PQ P 1/(2p)
PR × RS PP PP P 1/(4p)
PR × QS PP PP P 1/(4p)
PQ × PR PP PP P 1/(2p)
PQ × PQ PP PP P 1/(2p)
4.5.2.3  Y-STR檢測系統(tǒng)的PI值計算
    PI=1/f （f指單倍型在群體中的頻率）
4.5.2.4   X-STR檢測系統(tǒng)的PI值計算（見表4、表5）
    表4 三聯(lián)體X染色體STR基因座親權指數(shù)計算公式
孩子生母基因分型結果 女孩基因分型結果 被檢父基因分型結果 PI值計算公式
PP PP P 1/p
PQ PP P 1/p
PP PQ Q 1/q
PQ PQ P 1/(p+q)
PQ PR R 1/r
    表5 二聯(lián)體X染色體STR基因座親權指數(shù)計算公式
女孩樣本分型結果 被檢父樣本分型結果 PI值計算公式
PP P 1/p
PQ P 1/(2p)
4.6 檢驗過程中特殊情況的處理
    a)經DNA檢測（系統(tǒng)的累計非父排除率在99.99%以上），發(fā)現(xiàn)各基因座符合相應的遺傳定律，2000<CPI<10000，增加檢測其它的具有高度多態(tài)性且遺傳穩(wěn)定的DNA遺傳標記亦未發(fā)現(xiàn)不符合遺傳規(guī)律的基因座，可據(jù)此支持親權關系的存在。
    b)經常染色體DNA檢測（系統(tǒng)的累計非父排除率在99.99%以上），發(fā)現(xiàn)1~2個基因座不符合相應的遺傳定律（考慮存在突變），這種情形下，應增加檢測其它的高度多態(tài)性且遺傳穩(wěn)定的STR基因座；若被檢驗的孩子為女孩，應盡可能對被檢父母與女孩增加檢測 X-STR；若被檢驗的孩子為男孩，且被檢父與孩子可能的生父不屬同一父系，應盡可能對被檢父與男孩增加Y-STR的檢驗。將突變基因座寫入報告書中，并按突變基因座PI值的計算方法（見備注）計算PI和CPI值。計算后若發(fā)現(xiàn)CPI≤0.0001，則據(jù)此排除親權關系；若0.0001＜CPI＜10000，則不排除親權關系。
    備注1：若三聯(lián)體中存在不符合遺傳規(guī)律的常染色體遺傳標記，如孩子的表型為PQ，被檢測男子表型為P'R，其中P'比P 小或大1個或2個重復單位（s=1或2），μ為該基因座平均突變率，p為等位基因P的頻率，親權指數(shù)計算方法為：
    突變?yōu)?步(s=1), 則: PI =X/Y = μ/(4p)
    突變?yōu)?步(s=2), 則: PI =X/Y = μ/(40p)
    突變?yōu)?步(s=3), 則: PI =X/Y = μ/(400p)
    余此類推（見表6）
    表6 三聯(lián)體中存在不符合遺傳規(guī)律的遺傳標記時親權指數(shù)計算實例
    (以D7S820為例，平均突變率μ為0.002 )
基因座 孩子生母 孩子 被檢測父親 親權指數(shù)
D7S820 7 7-8 9-11 μ/(4P8)
D7S820 7 7-8 10-11 μ/(40P8)
D7S820 7 7-8 11-12 μ/(400P8)
D7S820 7 7-8 9 μ/(2P8)
D7S820 7-8 8 9 μ/(2P8)
D7S820 7-8 8 7-9 2μ/(4P8)
D7S820 7-8 8 9-11 μ/(4P8)
D7S820 7-9 7-9 10-11 μ/[4(P7 + P9)]
D7S820 7-9 7-9 10 μ/[2(P7 + P9)]
D7S820 7-9 7-9 8-10 3μ/[4(P7 + P9)]
D7S820 7-8 7-9 7-8 μ(1+1/3.5)/(4P9)
D7S820 9 7-8 7 μ /(2×3.5×P8)
    注：表中P7、P8、P9為相應等位基因7、8、9的頻率
    備注2：若二聯(lián)體中存在不符合遺傳規(guī)律的常染色體遺傳標記，如孩子的表型為PQ，被檢測男子表型為P'R，其中P'比P 小或大1個或2個重復單位（s=1或2），μ為該基因座平均突變率，p為等位基因P的頻率，則親權指數(shù)計算方法為：
    突變?yōu)?步(s=1)，則: PI =X/Y = μ/(8p)
    突變?yōu)?步(s=2)，則: PI =X/Y = μ/(80p)
    突變?yōu)?步(s=3)，則: PI =X/Y = μ/(800p)
    余此類推（見表7）
    表7 二聯(lián)體中存在不符合遺傳規(guī)律的遺傳標記時親權指數(shù)計算實例
    (以D7S820為例，平均突變率μ為0.002 )
基因座 孩子 被檢測男子 親權指數(shù)
D7S820 7-8 9-11 μ/(8P8)
D7S820 7-8 10-11 μ/(80P8)
D7S820 7-8 11-12 μ/(800P8)
D7S820 7-8 9 μ/(4P8)
D7S820 8 9 μ/(2P8)
D7S820 8 7-9 2μ/(4P8)
D7S820 8 9-11 μ/(4P8)
D7S820 7-9 8-10 μ(2P7+P9)/(8P7P9)
D7S820 7-9 8 μ(P7+P9)/(4P7P9)
    注：表中P7、P8、P9為相應等位基因7、8、9的頻率
c)   若被檢父與可能的生父存在特殊的血緣關系（如父子關系、叔侄關系、同胞兄弟關系等），在可能的情況下，應同時提取孩子生母和其他的可疑父親的樣本進行檢驗。
d)   在祖孫關系鑒定中，經常染色體DNA檢測（系統(tǒng)的累計非父排除率在99.99%以上），若發(fā)現(xiàn)1～2個基因座不符合相應的遺傳定律（考慮存在突變），應增加檢測其它的高度多態(tài)性且遺傳穩(wěn)定的STR基因座；若被檢驗的孩子為女孩，應盡可能對被檢祖母與孫女增加X-STR的檢驗；若被檢驗的孩子為男孩，應盡可能對被檢祖父與孫子增加Y-STR的檢驗。若仍然只有原來的基因座不符合遺傳規(guī)律，則將這些基因座當作突變基因座處理，寫入報告書中，出具“不排除存在生物學祖孫關系”的鑒定意見。