(一)福爾馬林固定

    甲醛有效固定作用的要點(diǎn)是在蛋白質(zhì)末端基因之間形成交聯(lián)鏈。參與甲醛固定蛋白質(zhì)的基團(tuán)，主要為氨基、亞氨基、酰胺基、肽、胍基、羥基、巰基和芳香環(huán)。甲醛與組織蛋白類的反應(yīng)時(shí)多樣和復(fù)雜的，因?yàn)樗芎投喾N不同的功能基因結(jié)合，在多數(shù)情況下在其間形成橋鍵。甲醛這種交聯(lián)的功能，雖然發(fā)揮了對(duì)組織固定的作用，但就DNA檢測(cè)而言，卻產(chǎn)生了不利的影響。正是因?yàn)镈NA與蛋白質(zhì)之間經(jīng)廣泛交聯(lián)后形成牢固的復(fù)合物，阻礙了蛋白酶對(duì)組織的消化，從而影響甲醛固定石蠟包埋組織及病理切片的DNA提取，并阻礙其后PCR擴(kuò)增過(guò)程中引物與模板的結(jié)合及引物的延伸。最為致命的是隨固定時(shí)間延長(zhǎng)，DNA分子會(huì)呈現(xiàn)可逆性亞氨基和氨基的羥甲基化，生物大分子之間緩慢形成廣泛的亞甲基交聯(lián)橋，導(dǎo)致DNA鏈的脆性增加，從而使其受到剪切力作用時(shí)，發(fā)生隨機(jī)斷裂，即通常所說(shuō)的DNA降解，這是甲醛本身造成的DNA分子損傷。除此之外，甲醛與氧化性物質(zhì)接觸后形成的甲酸，可改變環(huán)境PH，從而影響DNA分子的穩(wěn)定性，使核酸中嘌呤基的β-糖苷鍵容易發(fā)生水解而導(dǎo)致DNA鏈斷裂。因此，很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，福爾馬林固定時(shí)間越長(zhǎng)，甲醛所致的DNA損傷越嚴(yán)重，越不易從獲得大片段DNA。

    （二）洗滌與脫水

    固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，否則會(huì)影響以后的染色效果。多數(shù)用流水，固定后或洗滌后的組織內(nèi)充滿水分，如不除去水分就無(wú)法進(jìn)行以后的透明、浸蠟與包埋。乙醇為常用的脫水劑。

    (三)透明

    純乙醇不能與石蠟相容，還需用能與乙醇和石蠟相容的媒浸液，替換出組織內(nèi)的乙醇。材料塊在這類浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，此液即稱透明劑，透明劑的浸漬過(guò)程稱為透明。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各種透明劑均是石蠟的溶劑。DNA可能在此間因解除多種化學(xué)試劑而發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。

    （四）浸蠟與包埋

    用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用。在石蠟包埋過(guò)程中，DNA更容易發(fā)生降解，其可能的機(jī)制是組織浸蠟與包埋時(shí)需要加熱到62℃左右，此時(shí)DNA部分解鏈，組織內(nèi)殘留的痕量甲醛可對(duì)解鏈后的DNA單鏈進(jìn)行甲基化修飾，修飾后的DNA單鏈在冷卻后不易復(fù)性而更易發(fā)生降解。另外，石蠟可阻礙消化液對(duì)組織的滲透，從而抑制蛋白酶K與組織內(nèi)蛋白質(zhì)的接觸，影響組織消化和DNA釋放。

    （五）切片

    通常切片厚度4～7μm。合適的切片厚度也是影響DNA提取的重要因素之一。切片過(guò)厚不利于組織脫蠟和蛋白酶消化，切片過(guò)薄易造成DNA的機(jī)械損傷。

     (六)染色

    染色的目的是使細(xì)胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色以便于觀察。染色劑種類繁多，經(jīng)典的蘇木精和伊紅染色法是組織學(xué)標(biāo)本及病理切片標(biāo)本的常規(guī)染色，簡(jiǎn)稱H.E染色。有時(shí)不同的組織結(jié)構(gòu)還需要用特殊的染料及染色方法加以顯示，即特殊染色。染料常常是PCR的抑制劑。

    染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經(jīng)梯度乙醇脫水，在95%乙醇及純乙醇中的時(shí)間可適當(dāng)加長(zhǎng)以保證脫水徹底；二甲苯透明后，擦去材料周圍多余液體，滴加適量（1～2滴）中性樹膠，再將潔凈蓋玻片傾斜放下，封片后即制成永久性玻片標(biāo)本。