1．雜交：在雜交法中，針對SNP位點及側(cè)翼序列設(shè)計探針，通常探針間只有一個堿基的差異，分別對應(yīng)于不同的等位基因。在優(yōu)化的反應(yīng)（雜交、洗脫等）條件下，單堿基錯配足以破壞雜交體的形成，防止靶序列與錯誤的等位基因探針結(jié)合使其僅在序列完全匹配的情況下雜交。因為在分型反應(yīng)中不摻入酶，雜交是最簡單的機理。確保區(qū)分的難點在于探針設(shè)計。采用先進(jìn)的探針設(shè)計方法和雜交增強分子，如DNA水溝結(jié)合分子(minor groove binding molecule)，可提高探針設(shè)計的成功率。
2．引物延伸：引物延伸反應(yīng)的特異性表現(xiàn)在兩個方面：①DNA聚合酶摻入與模板互補堿基的高度特異性（如測序）；②DNA聚合酶引發(fā)延伸反應(yīng)時要求PCR引物的3′端與靶DNA序列完全互補的嚴(yán)格性(如等位基因特異性PCR)。引物延伸法在應(yīng)用中靈活性高，具有大量變化形式，所需引物和探針數(shù)目較少，并且探針設(shè)計和優(yōu)化較為簡便。
3．連接：DNA連接酶在修復(fù)DNA分子缺刻時具有高度的序列特異性。兩條相鄰的寡核苷酸與模板退火，僅當(dāng)其在接合處與模板完全匹配時才會在連接酶的作用下連接在一起，因而等位基因特異性寡核苷酸能夠探查多態(tài)性位點堿基的性質(zhì)。盡管連接反應(yīng)在所有等位基因區(qū)分機理中最具特異性且最易優(yōu)化，但它的反應(yīng)速度最慢且需要大量的修飾探針。
4．侵入切割：針對特定結(jié)構(gòu)的切割酶能夠切割部分重疊的寡核苷酸探針雜交形成的復(fù)合物。侵入切割(invasive cleavage)反應(yīng)中需要使用兩條分別對應(yīng)于野生型和突變型的寡核苷酸探針和一條位于上游的侵入探針。設(shè)計探針時將多態(tài)性位點置于重疊處，正確的重疊結(jié)構(gòu)僅在侵入探針和完全匹配的等位基因特異性探針間形成，而非單堿基錯配的探針。切割產(chǎn)物用于產(chǎn)生信號的次級反應(yīng)中。此信號放大步驟幫助捉高標(biāo)記切割產(chǎn)物的量不經(jīng)靶序列擴增即可實現(xiàn)檢測。此方法的優(yōu)點在于等溫反應(yīng)和無需PCR擴增即可分型，但尚存一些技術(shù)問題有待解決：①反應(yīng)需大量基因組DNA;②需要高純度的特異性探針才可忽略非特異性反應(yīng)；③因為在相同條件下連續(xù)反應(yīng)，而且SNP序列固定，所以探針設(shè)計較復(fù)雜。
